Bio-Rad伯乐PCR仪故障维修检测排查指南

Bio-Rad伯乐PCR仪故障维修检测排查指南：Bio-Rad伯乐PCR仪中的常见问题主要与反应条件、序列准确性以及扩增产率和特异性有关。在分子克隆中，从mRNA分子模板合成cDNA后，必须设计PCR程序来扩增目的基因，并添加其他元素，如限制性位点或检测或纯化标签。基因序列的内在特性，如高GC含量、相同多核苷酸的长段以及编码发夹环结构的序列都可能影响Bio-Rad伯乐PCR仪的使用效率。使用下面的故障排查指南来确定Bio-Rad伯乐PCR仪失败的原因及应对方法。

Bio-Rad伯乐PCR仪检出率低或无

1）PCR循环次数不足：将Bio-Rad伯乐PCR仪循环次数增加5个。

2）Bio-Rad伯乐PCR仪模板已降级：使用电泳检查DNA质量。

3）模板被PC抑制剂污染：1.检查260和280nm处的DNA吸光度比。纯DNA的260/280比例应为≥1.8。2.在反应中使用较少体积的模板。3.使用DNA纯化试剂盒或乙醇沉淀去除 污染物。

4）热循环仪程序退火和延伸温度不是最佳的：1.遵循PCR设计的一般规则：退火温度=最低引物Tm – 5°C，延伸温度=72°C。2.逐步将退火温度降低6至10°C 。

5）反应缺少Taq聚合酶或其他反应组分：确保将每种组分添加到PCR反应中。

6）Bio-Rad伯乐PCR仪引物浓度过低：检查引物浓度；如有必要，增加注意力。

7）靶标序列不在DNA模板中：1.从源头重新提取脱氢酶。2.测试模板的另一个区域。

8）Bio-Rad伯乐PCR仪模板不足：增加DNA模板的浓度。

9）Bio-Rad伯乐PCR仪反应组分浓度不理想：检查推荐的引物浓度（通常从 0.05-1毫摩尔）和毫克++浓度（通常为0.2-1毫摩尔）。

10）反应混合物组分受损：1.检查组件的到期日期。2.等分试反应混合物的生物成分，避免多次冻融循环。

11）引物设计不理想（导致非特异性退火或引物二聚体形成）：1.遵循底漆设计的一般规则：长度为18-30 核苷酸，GC含量在40-60%之间，引物Tm在5°C以内彼此。2.避免拉伸4个或更多相同的核苷酸或 二核苷酸重复。3.避免引物中的自互补序列。

来自Bio-Rad伯乐PCR仪反应的多种/非特异性产物

1）引物设计不理想（导致非特异性退火或引物二聚体形成）：1.遵循底漆设计的一般规则：长度为18-30 核苷酸，GC含量在40-60%之间，引物Tm在5°C以内彼此。2.避免拉伸 4 个或更多相同的核苷酸或 二核苷酸重复。3.避免引物中的自互补序列。

2）Bio-Rad伯乐PCR仪模板或反应混合物组分被污染：1.重新提取模板。2.尝试新的反应混合物。3.在反应设置期间使用过滤器移液器吸头并戴上手套。

3）Bio-Rad伯乐PCR仪退火温度过低：逐步提高退火温度。

4）Bio-Rad伯乐PCR仪引物浓度过高：少用底漆。

5）模板浓度不理想：1.对于质粒，使用1 pg-10 ng的DNA / 50μl反应。2.对于基因组DNA，使用1纳克-1微克的DNA/ 50微升反应。

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